Государственная фармакопея Республики Беларусь -
Скачать (прямая ссылка):
Через 3 часа после инъекции у анестезированной крысы удаляют обе надпочечные железы, освобождают их от посторонних тканей и по возможности быстро взвешивают для предотвращения потери массы. Крысу умерщвляют и исследуют на предмет полноты гипофизэктомии.
Пару надпочечников измельчают и гомогенизируют в свежеприготовленном растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л и разбавляют тем же раствором до 10 мл. Гомогенат выдерживают в течение 30 минут, после чего центрифугируют. 7 мл прозрачного супернатанта добавляют к свежеприготовленной смеси, состоящей из 7 мл раствора натрия ацетата R концентрацией 45,3 г/л со значением рН, доведенным до 7 путем добавления уксусной кислоты R, 3 мл воды R и 2 мл стандартного раствора дихлорфенолиндофенола R. Через 30 секунд после смешивания измеряют светопоглощение с помощью колориметра, используя фильтр с максимумом пропускания при 470 нм, в диапазоне пропускания от 450 до 520 нм. Содержание аскорбиновой кислоты вычисляют из стандартной кривой, которую получают аналогичной обработкой подходящих объемов свежеприготовленного раствора аскорбиновой кислоты R в растворе метафосфорной кислоты R концентрацией 25 г/л. Результаты выражают в миллиграммах на 100 г надпочечной железы. Результат количественного определения получают с использованием обычных статистических методов.
2.7.4. КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРА СВЕРТЫВАНИЯ КРОВИ VIII
Количественное определение фактора свертывания крови VIII производят по его биологической активности в качестве кофактора активации фактора Х активированным фактором IX (фактором 1Ха) в присутствии ионов кальция и фосфолипидов. Активность препарата фактора VIII оценивают путем сравнения количества, необходимого для достижения определенной скорости образования фактора Ха в испытуемой смеси, содержащей вещества, принимающие участие в активации фактора Х, и количества Международного Стандарта или препарата сравнения, калиброванного в Международных Единицах, которое требуется для получения такой же скорости образования фактора Ха.
За Международную Единицу принимают активность фактора VIII в установленном количестве Международного Стандарта, состоящего из высушенного из замороженного состояния концентрата человеческого фактора свертывания крови
VIII. Эквивалентность Международного Стандарта в Международных Единицах устанавливается Всемирной организацией здравоохранения.
Стандартный образец человеческий фактор свертывания крови VIII BRP калиброван в Международных Единицах в сравнении с Международным Стандартом.
Хромогенный метод количественного определения включает две последовательные стадии: зависящая от фактора VIII активация фактора Х в реагенте факторов свертывания, состоящем из очищенных компонентов, и ферментативное расщепление хромогенного субстрата фактором Ха с образованием хромофора, который определяют спектрофотометрически. В соответствующих условиях испытания существует линейная зависимость между скоростью образования фактора Ха и концентрацией фактора VIII. Содержание метода количественного определения описывается следующей схемой:
(активированный) фактор УШ
1-я стадия Фактор X ------------------------------> Фактор Ха
Фактор 1Ха, фосфолипид, Са2+
Фактор Ха
2-я стадия хромогенный субстрат ------------> пептид + хромофор
В обеих стадиях используются реагенты, доступные из ряда коммерческих источников. Хотя в состав реагентов могут вноситься некоторые изменения, их основные свойства должны соответствовать нижеприведенным спецификациям. Отклонения от этого описания допустимы при условии, что с использованием в качестве препарата сравнения Международного Стандарта концентрата человеческого фактора свертывания крови VIII показано отсутствие существенных различий в результатах.
Коммерчески доступные наборы для количественного определения следует использовать в соответствии с инструкциями изготовителя; важно убедиться в том, что используемый набор подходит для данного количественного определения.
РЕАГЕНТЫ
Реагент факторов коагуляции состоит из очищенных белков человеческого или говяжьего происхождения, включающих фактор Х, фактор IXa и активатор фактора VIII, обычно тромбин. Эти белки подвергнуты частичной очистке, предпочтительно, не менее чем до 50%, и не должны содержать примесей, мешающих активации фактора VIII или фактора Х. Фактор Х содержится в количествах, приводящих к конечной концентрации на первой стадии определения, находящейся в пределах 10-350 нмоль/л, предпочтительно 15-30 нмоль/л. Фактор IXa готовят активацией очищенного фактора IX с использованием фактора XIa и получением фактора IXab и дальнейшей очисткой фактора IXab из реакционной смеси. Его окончательная концентрация в процессе образования фактора Ха должна составлять менее 30% от концентрации фактора Х, обычно 1-100 нмоль/л, предпочтительно 1-10 нмоль/л. Тромбин может присутствовать в форме его предшественника - протромбина, при условии, что его активация в реагенте протекает с достаточной скоростью для практически мгновенной и полной активации в эксперименте фактора VIII. Фосфолипиды могут быть получены из природных источников, например, из головного или спинного мозга крупного рогатого скота, соевого экстракта или синтетическим путем, и должны состоять в существенной степени (обычно от 15 до 35%) из фосфатидилсеринов. Окончательная
